水稻基因组编辑与无融合生殖创新团队研发第二代高通量蛋白互作组鉴定技术
近日，中国水稻研究所水稻基因组编辑与无融合生殖创新团队在期刊Journal of Integrative Plant Biology发表题为“Interspecies rice versus Arabidopsis thaliana protein-protein interactome profiling by touch-down overlapping PCR coupled with HiFi long-read sequencing”的研究论文，成功研发第二代低成本、高通量鉴定蛋白互作技术—TDOP-seq，并运用于跨物种蛋白互作研究，成功鉴定到水稻和拟南芥的互作蛋白组合7726个，为物种间蛋白互作组研究提供了强有力的技术支持。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是指两个或多个蛋白质结合在一起，通常形成执行细胞基本功能的复合物。目前PPI鉴定已成为现代生物学的主要研究内容。然而，经典的PPI鉴定技术局限于单个或少数蛋白的互作关联，通量和效率偏低，此外，大多数已报道的蛋白质相互作用组图谱研究均在特定物种内开展；然而，物种间蛋白质相互作用组分析对于理解宿主-病原体互作，以及将已深入研究的模式生物的功能信息拓展至其他物种具有重大意义。
TDOP-seq整合了三大策略，即Touch-down、重叠PCR以及HiFi三代测序，其中TDO-PCR扩增技术作为核心环节，通过巧妙的引物设计和温度控制，实现了“诱饵”与“猎物”蛋白互补DNA的高效拼接。该扩增过程分为两个阶段：前10个循环采用高退火温度，利用低浓度引物富集两种蛋白的互补DNA；后20个循环则转为低退火温度，通过特异性重叠引物驱动拼接反应，将两者互补DNA无缝连接为完整片段。整个流程还引入Touch-down策略提升扩增效率，相比传统方法，不仅步骤简化、全部反应可一管完成，还将扩增时间缩短了约三分之二。
TDOP-seq技术对实验平台要求极低，是中小型分子生物学实验室开展蛋白互作组研究的利器。尤为重要的是，本研究成功鉴定到水稻和拟南芥的互作蛋白组合7726个，并通过已知的拟南芥蛋白功能，成功预测并验证了多个此前功能未知的水稻蛋白的功能，充分展示了跨物种PPI网络在填补非模式物种的蛋白组学知识空白方面的巨大潜力与应用价值。这项突破性技术不仅将极大加速基础生命科学中的蛋白质相互作用发现，也为系统生物学、宿主-病原体互作研究及作物遗传改良提供了强大的技术支持。此外，TDOP技术不仅仅适用于物种间蛋白互作组的研究，还适用于不同的物种内、不同杂交技术系统等不同场景，具有重大的应用价值。
图1. TDOP-seq的工作流程及其生物信息学分析
该研究得到农业生物育种国家科技重大专项、国家重点研发项目、国家自然科学基金项目、浙江省自然科学基金重大项目、浙江省自然科学基金项目、以及中国农业科学院农业科技创新工程的资助。我所助理研究员黄捷、特聘副研究员程宇以及我所与杭州师范大学联合培养硕士研究生阮静为该论文的共同第一作者。我所侯雨萱副研究员和张健研究员为该论文的通讯作者，杭州师范大学薛大伟教授及华中农业大学张建伟教授为本研究作出了重要贡献。
文章链接：https://doi.org/10.1111/jipb.70107