水稻基因组编辑及无融合生殖创新团队合作研究实现当代无外源转基因成分基因编辑

近日，水稻所水稻基因组编辑及无融合生殖创新团队与中国科学院遗传与发育生物学研究所（以下简称“中科院遗传所”）李家洋院士团队合作，在Cell子刊《Trends in Biotechnology》上发表了题为“Cas9-PE: a robust multiplex gene editing tool for simultaneous precise editing and site-specific random mutation in rice”的研究论文。该研究开发了一种名为Cas9-PE系统的新型多基因编辑工具，能够在水稻中同时实现精准编辑和位点特异性随机突变的聚合。研究人员通过该新型工具共编辑内源基因ALS赋予水稻除草剂抗性作为筛选标记，成功在当代（T0代）实现无外源转基因成分残留的多基因编辑目标，为分子设计育种提供了强有力的技术支持。

实现多个基因组位点上的不同突变类型聚合，并在遗传转化当T0代产生无外源转基因成分的植株，是作物育种的重要目标。虽然引导编辑（Prime Editing, PE）作为一项最新的精准基因编辑技术，能够实现任意类型的碱基替换以及小片段的插入或缺失，但在应用中，不同位点之间的编辑效率存在显著差异，使得在同一植株内聚合多种突变类型仍是一大挑战。此外，如何利用农杆菌转化在T0代获得无外源转基因成分的基因编辑植株也面临较大困难。

PE系统最初被开发的主要目的是用于治疗人类遗传疾病。为了提高编辑的精准性并减少非目标突变，该系统采用了切割DNA单链的切口酶nCas9（H840A）而非能产生DNA双链断裂的完整Cas9。与疾病治疗要求的高精准性目标不同，在作物育种中，不仅需要精准的基因编辑以引入期望的功能突变，而且希望保留一定的随机突变能力，这既可用于敲除导致不良表型或影响农艺性状的调控基因，也有助于产生意外的优异变异。基于这一需求，研究人员在高效植物ePE2系统基础上，将单链切割活性的nCas9恢复为双链切割活性的完整Cas9，在水稻中构建了由Cas9介导的PE（Cas9-PE）系统（图1）。Cas9-PE系统不仅保留了与pegRNAs结合进行精确编辑的能力，还获得了能与sgRNAs结合发挥靶向随机突变的新功能，具备生成大量变异类型的潜力，为分子设计育种提供有效工具。

对于多年生、无性繁殖及无融合生殖等无法通过后代遗传分离去除转基因成分的植物来说，在基因编辑过程中不引入外源转基因成分十分重要。已有研究表明，对内源乙酰乳酸合酶基因ALS进行S627I位点精准编辑，能够赋予水稻对除草剂双草醚（bispyribac-sodium，BS）的抗性。同时，在农杆菌介导的遗传转化过程中，存在T-DNA在愈伤细胞中不整合入染色体而瞬时表达携带基因的阶段，有机会获得无外源转基因成分的基因编辑植株（图1）。本研究中，研究人员利用Cas9-PE系统，在多基因编辑系统中引入精准编辑ALSS627I以获得对BS抗性，在愈伤组织筛选过程中，先用低浓度Hyg培养基培养一周，随后使用仅含有BS的培养基筛选抗性愈伤组织并再生，共获得23株水稻植株，其中7株ALSS627I位点发生精准编辑。进一步检测发现，其中有3株既无外源转基因成分又发生了ALSS627I位点的精准编辑，并且其中的2株完成了在其它目的基因上的精准编辑与随机突变聚合的多基因编辑。通过这种策略，Cas9-PE在T0代成功获得了无外源转基因成分的多基因编辑植株。

综上所述，Cas9-PE系统作为一种通用的多基因编辑工具，在聚合育种方面展现出巨大的应用潜力。该系统能够在T0代同时实现精准编辑和位点特异性随机突变的聚合，并生成不含外源转基因成分的编辑植株，因此具备高度的实用性和安全性。未来，随着进一步优化和完善，Cas9-PE系统的应用范围有望扩展到其他作物，特别是一些多年生、无性繁殖及无融合生殖植物，将显著加快作物育种改良的进程。

图1：水稻中Cas9-PE系统作用方式及实现T0代无外源转基因成分基因编辑策略

该研究得到国家重点研发计划、中国科学院基础研究领域青年团队计划项目、中国农科院科技创新工程和国家自然科学基金的资助。水稻所邹金鹏博士后和中科院遗传所孟祥兵高级工程师为该论文的共同第一作者，水稻所王春研究员和中科院遗传所余泓研究员为该论文的共同通讯作者。中科院遗传所李家洋院士和水稻所王克剑研究员对本研究进行了重要指导。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2024.10.012.