科技创新进展：创建一种简单高效的CRISPR-Cas9突变体筛选方法
近日，我所水稻染色体工程及基因组编辑创新团队与苏州大学黄健课题组合作, 基于常规聚合酶链式反应（PCR）原理，成功开发出临界退火温度PCR (ACT-PCR)用于快速高效地筛选基因编辑突变体。相关研究成果于04月 04日在线发表于《遗传学与基因组学（Journal of Genetics and Genomics）》杂志。
随着CRISPR-Cas9基因组编辑技术的广泛应用，科研人员需要进行大量的突变体筛选工作。目前通常的筛选方法包括对PCR产物限制性酶切、T7E1酶切、PAGE分析、溶解曲线分析等，这些方法存在着耗时费钱、位点特异或者需要特定仪器等缺点。因此，迫切需要开发一种简单高效的筛选方法。
PCR是分子生物实验的一种常规技术，主要由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。其中，特异性的引物以及适宜的退火温度是PCR反应能否成功扩增的关键因素。科研人员通过设计基因编辑位点特异引物，首先以野生型脱氧核糖核酸（DNA）为模板进行一次梯度PCR寻找出特异引物的临界退火温度，再在临界退火温度下进行PCR扩增筛选突变体。由于该特异引物不能和突变体DNA严格匹配，导致在临界退火温度下突变体中的PCR反应不能有效进行扩增。因此最终只需进行一次常规的PCR反应，便可以灵敏地检测出成功编辑的突变体。利用ACT-PCR，研究人员不仅在水稻中快速鉴定出单突变体和多突变体，同时也在斑马鱼中成功鉴定出突变体，表明ACT-PCR的应用不受物种的限制。除用于基因编辑突变体鉴定之外，研究还发现结合实时荧光定量PCR技术，ACT-PCR还可用于定量计算在细胞系中进行的基因编辑效率，与常用的PCR产物酶切等方法相比，通过定量ACT-PCR得到的数据更为接近于真实的编辑效率。
该研究得到国家自然科学基金以及中国农科院科技创新工程经费资助。我所华宇峰、王春和苏州大学黄健为该论文的共同第一作者，王克剑研究员为通讯作者。
文章链接:http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1673852717300577